Il Museo Civico ha la sua sede nel Palazzo Pubblico, edificio costruito in gran parte tra la fine del sec. XIII e la prima metà del XIV,  per ospitare i Nove signori che governavano la Repubblica di Siena. Al suo interno si trovano preziosi affreschi: La Maestà (1315), il Guidoriccio da Fogliano (1328) di Simone Martini (1284-1344) nella sala del Mappamondo, mentre il quella dei Nove il ciclo del Buon Governo (1339-39) di Ambrogio Lorenzetti (1285-1348), il cui significato etico politico del Governo Dei Nove.   Sono da ricordare il ciclo degli Uomini Famosi  (1413-14)di Taddeo di Bartolo (1362ca.-1422)

Le prime quattro sale (dette della Quadreria) espongono opere dei secoli XVI-XVIII, riordinate nel 1985. Sono opere soprattutto senesi, provenienti dalla collezione Spannocchi, tra le quali spicca la sinopia della Madonna col Bambino e santi del Sodoma, proveniente dalla Cappella di Piazza (1537-1539).

La Sala del Risorgimento che espone affreschi e sculture del XIX secolo. Alle pitture a soggetto storico risorgimentale lavorarono esclusivamente artisti toscani, per lo più senesi: Pietro Aldi, Giorgio Bandini, Amos Cassioli, Alessandro Franchi, Cesare Maccari, Gaetano Marinelli e altri. Tra le sculture spiccano lavori di Enea Becheroni, Giovanni Duprè, Emilio Gallori, Arnoldo Prunai, Tito Sarrocchi e altri.
Da qui si accede alla porzione più antica e prestigiosa del palazzo.

La prima di queste sale, detta Sala dei Priori o Sala della Balìa, è divisa in due sezioni da un arco e completamente ricoperta da affreschi. Vi si vedono Sedici Virtù nelle volte, di Martino di Bartolomeo (1408), mentre alle pareti spicca il ciclo sulla Vita di papa Alessandro III, papa senese, dipinti da Spinello Aretino e dal figlio Parri Spinelli (1407).
La porta lignea intarsiata è opera di Domenico di Niccolò, mentre il banco ligneo con intagli e intarsi è di Barna di Turino (1410). Dalla porta opposta all'ingresso si accede a una scalinata che porta ai piani superiori.

La Sala dei Cardinali, o Anticamera del Concistoro. Ha le pareti decorate da vari affreschi tre-quattrocenteschi staccati, che provengono da pareti esterne o da altri locali del palazzo. Tra questi spicca i Santi Caterina d'Alessandria, Giovanni e Agostino con un devoto attribuiti ad Ambrogio Lorenzetti e già sul portale d'ingresso alla Sala di Balìa.
Una vetrina al centro raccoglie alcuni cimeli dell'antica attività del Comune, tra cui cofanetti intagliati e intarsiati, bossoli per votazioni e la picca del Capitano del Popolo.

Attraverso un pregiato portale marmoreo di Bernardo Rossellino (1448) si passa alla Sala del Concistoro, dove i governanti si riunivano ai tempi della Repubblica. Le imposte lignee del portale, intarsiate, sono opera attribuita a Domenico di Niccolò. Sulle volte, si trovano affreschi allegorici di Domenico Beccafumi dedicati alle Virtù pubbliche e alla loro pratica nell'antichità (eseguiti con interruzioni dal 1529 al 1535). Sopra la porta il Giudizio di Salomone è un affresco attribuito a Luca Giordano.  

Dalla Sala dei Cardinali si accede anche al Vestibolo e alla cosiddetta Anticappella, a loro volta comunicanti tra di loro. Nel primo troviamo un affresco staccato dalla Loggia dei Nove, raffigurante la Madonna col Bambino di Ambrogio Lorenzetti (circa 1340); nel vestibolo, la Lupa allattante due gemelli, scultura dorata di Giovanni di Turino (1429-1430) proveniente dalla colonna all'ingresso del palazzo e recante sulla base gli stemmi della città, dei terzi e delle Compagnie militari dell'epoca.
L'Anticappella è affrescata da Taddeo di Bartolo (1415 circa), su temi mitologici e di storia romana; in una vetrina sono esposte oreficerie come la Rosa d'oro di Pio II, capolavoro di oreficeria eseguito da Simone da Firenze (1462), una pace databile al 1390 circa, dorata e smaltata e l'elmo del Capitano del Popolo, importante opera d'arte quattrocentesca. Questo ambiente è detto così perché precede la Cappella di Palazzo, decorata pure da affreschi di Taddeo, raffiguranti scene della Vita della Vergine, Santi, Evangelisti, Profeti e Virtù (1415 circa). La cancellata in ferro battuto e stagnato è un'opera del 1437 dei senesi Giacomo di Giovanni e suo figlio Giovanni. La piccola acquasantiera bronzea con figurette è invece opera di Giovanni di Turino e risale al 1434; il ricco lampadario ligneo, dorato e dipinto, è invece del 1435. L'altare venne disegnato dal Marrina, e conserva la tavola della Sacra Famiglia con san Leonardo del Sodoma (1530), qui trasferita dal Duomo nel XVII secolo. Il finissimo coro ligneo, intagliato e intarsiato, venne eseguito da Domenico di Niccolò (1415-1428) e conta ventidue stalli che corrono lungo le pareti. Per quest'opera l'artista venne soprannominato "dei Cori".
Nei pressi dell'altare, si trova l'organo a canne, opera di Giovanni di Antonio detto il Piffaro. Costruito tra il 1519 e il 1525, ha una cassa riccamente intagliata, con decorazioni di Giovanni di Pietro e Ghino d'Antonio. Lo strumento, a trasmissione integralmente meccanica originale, ha un'unica tastiera di 44 note (Do2-La5 senza Do#2) ed una pedaliera a leggio di 12 note costantemente unita al manuale. L'organo è stato restaurato nel 1983 da Pier Paolo Donati. Di seguito, la sua disposizione fonica:

La sala più grande e più famosa è la Sala del Mappamondo, detta anche Sala del Consiglio, che conserva due grandi affreschi: la Maestà di Simone Martini (1312-1315) e Guidoriccio da Fogliano all'assedio di Montemassi, attribuito tradizionalmente sempre a Simone Martini (1330), ma molto probabilmente un rifacimento quattrocentesco di un capolavoro perduto del maestro senese. Sotto di essa si trova l'affresco della Presa di un castello (forse di Giuncarico), opera attribuita non concordemente a Duccio di Buoninsegna, datata 1314, che ne fa la più antica decorazione sicura del palazzo.
Sotto venne applicato successivamente da Ambrogio Lorenzetti il mappamondo girevole che diede nome alla sala, ormai perduto, anche se le impronte del suo andamento girevole sono ancora visibili sull parete.
Sulla parete delle arcate, in alto, si vedono due grandi affreschi a monocromo sulle glorie militari di Siena: a sinistra la Vittoria dei senesi nella battaglia di Val di Chiana, di Lippo di Vanni (1363) e a destra la Vittoria dei senesi sui fiorentini al Poggio Imperiale di Poggibonsi (avvenuta nei pressi di Poggibonsi l'8 settembre 1479) di Giovanni di Cristofano e Francesco d'Andrea (1480). Completano la decorazione della sala una galleria dei più venerati santi senesi sui pilastri, da destra: i Beati Andrea Gallerani e Anbrogio Sansedoini, di autore cinquecentesco, Santa Caterina da Siena del Vecchietta (1460), San Bernardino di Sano di Pietro (1450), il Beato Bernardo Tolomei, fondatore degli Olivetani, del Sodoma (1533), Sant'Ansano e San Vittore del Sodoma (1530 circa).

Adiacente si trova l’altrettanto celebre e famosa Sala dei Nove (o Sala della Pace), dove Ambrogio Lorenzetti affrescò le celeberrime scene degli Effetti del Buono e del Cattivo Governo (1338-1339): sebbene in parte danneggiati (soprattutto nella parete del Cattivo governo), rappresentano uno straordinario esempio di allegoria politica, il più vasto ciclo profano del medioevo, con un'estesa raffigurazione del paesaggio. La grande composizione, di gusto allegorico-letterario, mostra le personificazioni di vari concetti astratti (coi nomi scritti in calce) e due paesaggi che rivelano gli effetti su una città e sulle campagne dei buoni e cattivi governatori.

Si accede infine alla Sala dei Pilastri che espone opere trecentesche e quattrocentesche per lo più di artisti minori: la Croce dipinta di Massarello di Gilio (1306), i Santi Stefano, Maria Maddalena e Antonio Abate di Martino di Bartolomeo (1306), la Predica e miracolo di san Bernardino, frammento di predella di Neroccio di Bartolomeo (1465 circa) e il rarissimo frammento di vetrata con un San Michele Arcangelo attribuito ad Ambrogio Lorenzetti.

Da una scala decorata dall'affresco di una Madonna di Neroccio di Bartolomeo Landi del 1481, si arriva a tre sale del secondo piano, dove un tempo erano esposti gli originali della Fonte Gaia di Jacopo della Quercia, oggi nel complesso museale di Santa Maria della Scala. Da qui si sale alla Loggia, retta da quattro pilastri, che ha una straordinaria vista sulla piazza del Mercato e sulla metà sud della città.

La Sala del Capitano del Popolo è oggi sede di riunione del Consiglio comunale, decorata da due tele di Amos Cassioli (Giuramento di Pontida e Provenzano Salvani nel campo di Siena) e da lunette tardo-cinquecentesche con Storie senesi.
Altre sale mostrano la raccolta di stampe (opere di Jacques Callot e Stefano Della Bella), dipinti del Sei e Settecento, una galleria di ritratti di sensi illustri, carte geografiche, documenti su Siena e il Palio, e infine una piccola raccolta di modelli in legno e gesso. Tra le decorazioni spiccano il Crocifisso ad affresco di Pietro di Giovanni d'Ambrogio (1446, nella prima sala) e un soffitto del 1680 (seconda sala).