In den Katakomben von San Sebastiano wurden vier Ebenen ausgegraben. In der Nähe der Katakomben führt der Appian Way durch ein Tal. An seinen Hängen wurden Häuser und Columbarii gebaut. Im Talgrund ("ad catacumbas", heute Synonym für unterirdischen Friedhof) wurden drei Mausoleen errichtet, die wahrscheinlich den Beginn des Friedhofs markierten. Als die Kirche im 3. Jahrhundert Eigentümer der Stätte wurde, waren die Mausoleen von einer Plattform bedeckt, die als überdachter Innenhof, Triclia genannt, angeordnet war. Im 4. Jahrhundert wurde eine Basilika mit einem Langhaus und zwei Gängen über den früheren Bauten errichtet und von Mausoleen umgeben. Hier, in der Nähe der Apostel Petrus und Paulus, wurde der heilige Sebastian begraben. Er war ein Soldat, der während der Verfolgung unter Diokletians Herrschaft (284-305) gemartert wurde. Als er schließlich 286 als Christ entdeckt wurde, wurde er den mauretanischen Bogenschützen übergeben, die ihn mit Pfeilen durchbohrten. Er wurde schließlich durch Schläge eines Schlägers getötet und sein Körper wurde in die Cloaca Maxima geworfen. Wie durch ein Wunder erschien er der Oberin Irene, die seinen Körper einsammelte und zu den Katakomben trug, die seinen Namen tragen. Sein Kult wurde so beliebt, dass im 5. Jahrhundert eine Gruft um sein Grab ausgehoben wurde. Die Basilika wurde im 13. Jahrhundert umgebaut und im 17. Jahrhundert für den Kardinal Scipio Borghese umgebaut. Die neue Kirche wurde über dem Langhaus des vorherigen Gebäudes errichtet.

Die Besichtigung dieser Katakombe mit heidnischen Gräbern aus dem 2. Jahrhundert und christlichen Kapellen führt Sie eine Treppe hinunter, die mit Sarkophagstückchen und kaiserlichen Siegeln besetzt ist. Unter der Kirche sehen Sie einen Bereich mit drei dekorierten heidnischen Gräbern mit einigen sehr attraktiven Fresken und einem Bodenmosaik. Es wird vermutet, dass sowohl christliche als auch heidnische Begräbnisse in der kunstvollen Hauptkapelle abgehalten wurden, deren Gewölbe mit Akanthus- und Lotusblatt-Stuckverzierungen versehen ist. In die Symbolkapelle sind frühe christliche Symbole eingemeißelt. Eine weitere Treppe hinauf ist ein Speisesaal für Trauergäste. Die Graffiti stammen aus dem zweiten Jahrhundert.