La prima pietra della chiesa fu posta il 17 aprile 1565 da Cosimo I de' Medici, il committente del rinnovato spazio pubblico di piazza dei Cavalieri per l'Ordine dei cavalieri di Santo Stefano, fondato dal granduca per combattere la pirateria turca nel Mediterraneo.

Progettata da Giorgio Vasari, per costruirla in piena libertà venne demolita una vecchia chiesa di San Sebastiano alle Fabbriche Maggiori, citata dal 1074, che prendeva il nome dalle officine dei fabbri presenti nella zona, almeno dal VII al XIII secolo. Ai lavori sovrintese David Fortini e furono ultimati nell'agosto del 1567; il 21 dicembre 1569 la chiesa venne consacrata.

Il campanile venne aggiunto tra il 1570 e il 1572: caratterizzato da un'elegante cella campanaria con trifore, fu eretto da Giovanni Fancelli su disegno del Vasari.

Nel secolo successivo fu decorata con la maggior parte delle tele che ancora vi sono esposte, dipinte dai maggiori maestri del Seicento fiorentino. l'altare e la navata furono progettati da Pier Francesco Silvani.
Tra il 1683 e il 1691 furono edificati i due corpi laterali, usati come spogliatoi e magazzini dei cavalieri. Nel Settecento alcuni progetti (di Gherardo Mechini, Paolo Guidotti...) suggerirono di trasformare la pianta della chiesa a croce latina, ma non vennero messi in opera.

Nell'Ottocento di nuovo fu indetto un concorso per rinnovare drasticamente il volto della chiesa: dei numerosi progetti pervenuti (di Ranieri Gherardi, Torpè Donati, Alessandro Gherardesca, Florido Galli, Niccolò Matas e Pasquale Poccianti) venne scelto quello del Poccianti, che prevedeva la realizzazione di due navate laterali articolate per mezzo di grandi colonnati, ma nessuno venne attuato. Nel 1859 l'ingegner Gaetano Niccoli, dopo la soppressione dell'Ordine, realizzò due vani simili a navate a partire dai corpi laterali, con la sistemazione che tutt'oggi si può vedere.
Oggi la chiesa fa parte del demanio ed è officiata da un rettore mons. Aldo Armani.

La facciata, in marmo bianco di Carrara, fu disegnata da Don Giovanni de' Medici, figliastro di Cosimo I, il cui progetto fu preferito a quello originario del Vasari. Venne coadiuvato da Alessandro Pieroni. È caratterizzata da due ordini con colonne, lesene, cornici laterali, un arco ribassato al centro e un timpani con lo stemma dei Medici e dell'Ordine di Santo Stefano. Un'iscrizione ricorda l'edificazione della chiesa e un'altra la realizzazione della facciata ai tempi di Ferdinando I de' Medici.

Le ali laterali vennero intonacate e decorate sobriamente nel 1934.
La chiesa ha una pianta rettangolare a navata unica con un coro quadrato e numerosi altari lignei che si aprono sui fianchi.

L'interno è vasto e luminoso e presenta una sontuosa decorazione tesa a celebrare le imprese dell'Ordine dei cavalieri di Santo Stefano.

Tra i numerosi trofei di guerra che adornano la chiesa spicca la preziosa serie di bandiere, in gran parte conquistate ai turchi durante i ripetuti scontri navali, realizzate tra la metà del XVI e gli inizi del XVIII secolo, insieme ad antichi fanali di navi collocati tra le ampie finestre. Da un'imbarcazione da parata provengono i frammenti scultorei disposti in controfacciata e lungo la parete destra, in legno policromo, in cui sono scolpite espressive figure di schiavi turchi mischiati ad animali ed armi, della fine del XVII secolo. Le acquasantiere sono di Giovanni Fancelli, scolpite su disegno del Vasari (1568).

Sempre in controfacciata e lungo le pareti sono cinque dipinti a monocromo, con Storie di Santo Stefano papa e martire, unica preziosa testimonianza dell'addobbo allestito per celebrare l'ingresso in città del granduca Ferdinando II (31 marzo 1588), cui si deve la commissione del prezioso soffitto ligneo, intagliato e dorato dall'intagliatore Bartolomeo Atticciati (1604). Il soffitto include sei dipinti su tavola raffiguranti episodi militari e civili dell'Ordine, eseguiti dai principali artisti fiorentini legati al casato mediceo; iniziando dall'altare maggiore troviamo la Vestizione di Cosimo I de' Medici di Ludovico Cardi detto il Cigoli, il Ritorno della flotta dalla battaglia di Lepanto di Jacopo Ligozzi, L'imbarco di Maria de' Medici a Livorno di Cristofano Allori, la Vittoria nell'arcipelago greco di Jacopo Chimenti detto l'Empoli, cui spetta anche La presa della città di Bona e L'espugnazione della città di Prevesa di nuovo del Ligozzi.

Lungo la parete sinistra sorge il pulpito, in marmi policromi, del fiorentino Chiarissimo Fancelli (1627), proveniente dal duomo, sopra il quale è il dipinto del pisano Aurelio Lomi con Madonna con bambino tra i santi Giuseppe e Stefano del 1593, eseguito per il vicino palazzo dell'Ordine dei Cavalieri.

Nel presbiterio spicca il prezioso altare maggiore, realizzato in marmi policromi e bronzo dorato da Giovanni Battista Foggini (1702-09), cui spettano anche le statue di Santo Stefano papa tra le figure allegoriche della Religione e della Fede, e il trono in bronzo con il rilievo della Decapitazione di santo Stefano.

Nell'urna sottostante si conservano le reliquie del santo titolare giunte a Pisa da Trani nel 1682.
Nell'ala destra si conserva il dipinto di Giorgio Vasari, cui spetta il progetto iniziale della chiesa, con la Lapidazione di santo Stefano (1571), mentre nell'ala sinistra si trova una splendida Natività di Cristo del fiorentino Bronzino (firmata e datata 1564).

Nella sagrestia è collocato il gruppo scultoreo con Santo Stefano e le allegorie della Ragione e della Trinità realizzato dal Foggini nel 1683 in occasione della traslazione del corpo del santo. Ancora a Giorgio Vasari spetta il disegno delle due acquasantiere in marmo, all'ingresso della chiesa, realizzate da Giovanni Fancelli nel 1568.
La vicina cappella del santissimo Sacramento è una realizzazione di Florido Galli (1837).