La construction a commencé le 17 avril 1565 afin de construire une église pour l'Ordre des Chevaliers de St Stephan, fondée par le Grand-Duc Cosimo de 'Medici pour lutter contre la piraterie sarrasine en Méditerranée. Le projet, conçu et supervisé par Giorgio Vasari et David Fortini, consistait à construire une église sur le site d’une église plus ancienne appelée San Sebastiano alle Fabbriche Maggiori, datant au moins de 1074. La nouvelle église sur le site a été consacrée le 21 décembre au 21 décembre. 1569. La façade en marbre blanc a été conçue par Don Giovanni de Medici, fils illégitime de Cosimo Ier, avec l'aide d'Alessandro Pieroni; leurs dessins ont été choisis par rapport au plan original de Vasari. Une inscription commémore l'achèvement sous le règne de Ferdinando I de 'Medici.
Le clocher, également conçu par Vasari, a été complété en 1572 par Giovanni Fancelli. Les dessins de l'autel principal étaient de Pier Francesco Silvani. De nombreux changements et ajouts ont été proposés et apportés au cours des deux siècles suivants, notamment les plans de Gherardo Mechini, Paolo Guidotti, Ranieri Gherardi, Torpè Donati, Alessandro Gherardesca, Florido Galli, Niccolò Matas et Pasquale Poccianti. La reconstruction finale en 1859, achevée après la suppression de l'ordre, crée une systématisation plus claire des colonnes à l'intérieur que nous voyons aujourd'hui.
L'église affiche de nombreuses bannières de trophées, capturées lors de rencontres navales avec des pirates sarrasins. La police pour eau bénite (1568) a été sculptée par Giovanni Fancelli, d'après les dessins de Vasari.
La contre-façade contient cinq peintures monochromes de Stories de St Stefano Pope et Martyr, dont une célébrant l'entrée de Ferdinando Ier le 31 mars 1588. Ce grand-duc devait commander le plafond en bois de Bartolomeo Atticciati ( 1604).
Le plafond comporte six peintures sur bois illustrant des épisodes d'événements historiques dans lesquels l'ordre militaire était actif, notamment la Remise d'uniformes de Cosimo I de 'Medici d'Il Cigoli, le Retour de la flotte de la bataille de Lépante et le pillage de Prevesa par Jacopo Ligozzi, l'embarquement à Livourne de Maria de 'Medici d'Allori, la victoire dans l'archipel grec et la capture de Bona par l'Empoli.
La chaire polychrome (1627) a été complétée par Chiarissimo Fancelli. Il contient des peintures de Pisan Aurelio Lomi de Madonna et de l'enfant avec les saints Joseph et Stefano (1593) et une peinture du palais de l'Ordre.
L'autel principal (1702–1709) du presbytère a été conçu et sculpté par Giovanni Battista Foggini avec une statue de St Stefano Pope et des figures allégoriques de la religion et de la foi, et sur le trône de bronze, un relief avec la décapitation de St Stefano. A droite, un tableau de Giorgio Vasari, avec la mise au tombeau de St Stefano (1571), à droite, une naissance du Christ (1564) de Bronzino.
Dans la sacristie est un groupe sculptural par Foggini de St Stefano et l'allégorie de la raison et de la trinité (1683), faite à l'occasion de la traduction du corps du saint à cette église en 1682.
La chapelle du Saint-Sacrement a été achevée en 1837 par Florido Galli.
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