Il museo, che occupa quasi interamente il primo piano del palazzo, raccoglie opere di grandi maestri della pittura italiana e straniera, dal XIII al XVIII secolo, fra cui Raffaello e Caravaggio. Il secondo piano ospita una raccolta di dipinti del settecento.

I Barberini avevano già cominciato ad alienare le loro collezioni nel Settecento con le vendite dell'ultima discendente, Cornelia Costanza, sposata a Giulio Cesare Colonna di Sciarra. Le liti ereditarie dei figli che si dovettero dividere le primogeniture Colonna e Barberini, portarono ad una divisione delle collezioni fra i due rami della famiglia, con un accordo stipulato a Parigi nel 1811.

Solo nel 1934 si arrivò alla definitiva dispersione delle collezioni, con l'avallo dello Stato, che, con una specifica legge, permise la vendita delle opere fidecommissarie in cambio di un piccolo nucleo in proprietà, rinunciando alla tutela di una delle più importanti collezioni fidecommissarie romane.

Nel 1984 si arrivò ad una migliore definizione dell'ordinamento riportandolo nella sua sede storica originaria la collezione Corsini, e portando tutte le opere di provenienza da acquisti o da collezioni prive della loro sede storica nel palazzo Barberini. L'intento era di creare in questa sede, quando fosse stato possibile, una Galleria Nazionale nel vero senso del termine, ordinata cronologicamente ma con la possibilità di inserire nel percorso acquisti e integrazioni, differente quindi come concezione dalla struttura definita dalle collezioni storiche del panorama romano, viceversa di impianto molto più vicino ai grandi musei stranieri e dotata come questi di tutti i più moderni servizi.

Nel complesso la collezione è ricchissima di capolavori, soprattutto dei secoli XVI e XVII. Non è rappresentato in modo completo il secolo XV, dove però spicca il fondamentale dipinto di Filippo Lippi con la Madonna in trono con Bambino, datato 1437, in deposito da Corneto Tarquinia. Più consistenti le collezioni del XVI secolo, fra le quali spicca per notorietà la Fornarina di Raffaello, oltre a dipinti di Andrea del Sarto, del Beccafumi, del Sodoma, del Bronzino, ad opere del Lotto, del Tintoretto, di Tiziano ed El Greco, fino ad opere bolognesi, per arrivare alla fine del secolo con la splendida Giuditta che taglia la testa ad Oloferne del Caravaggio e al grande Seicento con opere di Reni, Domenichino, Guercino, Lanfranco, Bernini, Poussin, Pietro da Cortona, Gaulli, Maratta. 

Molto ben rappresentata è anche la pittura del Settecento. Si articola in nuclei per scuole che danno un panorama completo e molto omogeneo per qualità, della pittura italiana del periodo, con in più un raro nucleo di dipinti francesi del Settecento.