Situate nei sotterranei del convento dei Padri Cappuccini dal 1599, anno della loro realizzazione; le gallerie che la compongono formano un ampio cimitero di forma rettangolare. Dal 1601, dato il gran numero di cadaveri che vi giungevano e soprattutto per le molte richieste di nobili che chiedevano ed ottenevano di essere sepolti in quel luogo, spinsero i frati ad ingrandire la sepoltura. 

Vi sono custodite circa 8000 salme imbalsamate, suddivise per sesso, categoria sociale e professione: il primo ad essere stato inumato all'interno delle catacombe fu frate Silvestro da Gubbio il 16 ottobre del 1599; la più recente risale al 1920 ed è quella di Rosalia Lombardo, una bambina di due anni, posta all’interno di una bara di cristallo, divenuta simbolo delle Catacombe. 

Quello che più colpisce il visitatore è il metodo utilizzato dai frati per la conservazione dei cadaveri: essi venivano introdotti in una stanza, distesi sopra una grata fatta di tubi di terracotta e chiuse ermeticamente le porte, vi restavano per un periodo di circa otto mesi - un anno, in seguito, venivano trasportati in un luogo ventilato coperto con tettoia, dove, venivano lavati e ripuliti con acqua ed aceto, quindi rivestiti e collocati nella casse di legno o nelle nicchie lungo i corridoi; rimanevano li solo se i parenti andavano a trovarli e portavano loro la cera per tre anni consecutivi altrimenti venivano rimossi.