Внутри катакомб Сан-Себастьяно были выкопаны четыре уровня. Рядом с катакомбами Аппиевый путь проходит через долину. На его склонах были построены дома и колумбарии. В нижней части долины (называемой «ad catacumbas», теперь синонимичной с подземным кладбищем) были возведены три мавзолея, которые, вероятно, положили начало кладбищу. Когда церковь стала владельцем этого места в 3-м веке, мавзолеи были покрыты платформой, устроенной в виде крытого двора, называемого триклия. В 4 веке над ранними постройками была построена базилика с нефом и двумя проходами, окруженная мавзолеями. Именно здесь, рядом с почитанием апостолов Петра и Павла, был похоронен святой Себастьян. Он был солдатом, принявшим мученическую смерть во время преследования во времена Диоклетиана (284-305). Когда в 286 году он, наконец, был обнаружен как христианин, его передали мавританским лучникам, которые пронзили его стрелами; он был наконец убит ударами дубины, и его тело было брошено в Максима Клоака. Он чудесным образом явился матроне Ирине, которая собрала его тело и отнесла в катакомбы, носящие его имя. Его культ стал настолько популярным, что в 5 веке вокруг его могилы был раскопан склеп. Базилика была изменена в 13 веке, а затем перестроена в 17 веке для кардинала Сципиона Боргезе. Новая церковь была построена над нефом предыдущего здания.

Тур по этой катакомбе, в которой есть языческие гробницы второго века и христианские часовни, приведет вас вниз по лестнице, усыпанной кусочками саркофагов с царскими печатями. Под церковью вы увидите область с тремя украшенными языческими гробницами с некоторыми очень привлекательными фресками и мозаикой на полу. Считается, что христианские и языческие похороны проводились в тщательно продуманной центральной часовне, свод которой украшен лепниной из аканта и листьев лотоса. В часовне символов вырезаны раннехристианские символы. Еще одна лестница - столовая для похоронных банкетов. Граффити датируются вторым веком.