Con un patrimonio di circa due milioni di volumi, 20.000 manoscritti, più di 8.000 periodici, 4.500 incunaboli e 1.800 papiri ercolanensi è, per consistenza, la terza biblioteca italiana dopo le due Nazionali Centrali di Roma e di Firenze. Le origini risalgono alla fine del XVIII secolo quando nel Palazzo degli Studi, oggi sede del Museo Archeologico Nazionale, furono raggruppate le raccolte librarie provenienti dalla Reggia di Capodimonte, inclusa la libreria farnesiana che Carlo di Borbone aveva ereditato dalla madre, Elisabetta Farnese. 

Il patrimonio si arricchì poi sia con i fondi provenienti dalla soppressione degli ordini religiosi che con l'acquisizione di biblioteche di privati ( tra i quali il legato Ranieri e la biblioteca teatrale Lucchesi Palli); nel 1910, vi fu annessa l'Officina dei Papiri Ercolanesi istituita da Carlo di Borbone per custodire e svolgere i papiri rinvenuti negli scavi di Ercolano. Nel 1922, su suggerimento di Benedetto Croce, fu trasferita nell’attuale sede del Palazzo Reale. In quegli anni furono annesse alla Nazionale la Biblioteca del Museo di San Martino, la Brancacciana, la Provinciale, la San Giacomo e, in seguito al trattato di Saínt Germain ed alla convenzione artistica di Vienna, fecero ritorno a Napoli i preziosissimi manoscritti che nel 1718 Carlo VI d'Asburgo aveva forzatamente fatto trasferire a Vienna, detti "ex viennesi". 

Ulteriori acquisizioni risalgono ad anni recenti, come il fondo Doria o la raccolta Pontieri e numerose altre finalizzate alla documentazione ed alla valorizzazione della cultura meridionale in tutti i suoi vari aspetti.