Tra il Prato di Castello ed il Cortile della Mostra, in una singolare piazzetta all'interno degli edifici di corte, il duca Guglielmo (1550-1587) affida all'architetto Giovanni Battista Bertani la costruzione della chiesa di palazzo. La fabbrica, dopo vari antefatti iniziati nel 1561, è conclusa nel 1572; il campanile, come testimonia l'epigrafe inserita nella parte inferiore, viene ultimato nel 1565. Nello stesso anno una bolla di Papa Pio IV istituisce un collegio canonicale presieduto da un abate dipendente direttamente dalla Santa Sede.
Fra gli altri privilegi viene anche concesso che la basilica goda di una liturgia propria; il duca acquisisce diverse reliquie di Santi per le quali vengono predisposti preziosi reliquiari (ora conservati al Museo Diocesano). Sempre nel 1565 viene costruito da Graziadio Antegnati l'organo; la chiesa, voluta da Guglielmo Gonzaga appasisonato musicista, viene dotata di una cappella musicale di grande prestigio (dal fiammingo De Wert, a Palestrina a Gastoldi).Il vestibolo a tre arcate è inserito in una facciata di gusto manieristico; l'architettura interna, pregna di citazioni culturali, è tutta permeata dalla luce che scende dalle due lanterne a padiglione emergenti dalla copertura della navata. Sopraelevato è il presbiterio con abside contro cui poggia parte degli stalli del coro provenienti dalla demolita chiesa di San Domenico (l'altra parte del coro è a Bondeno di Gonzaga). Da una scala a chiocciola si accede sotto il presbiterio alla cripta, di impianto architettonico singolare, per l'aula a tre navate che si conclude nel santuario di forma ellittica.
I dipinti meritano tutti di essere segnalati, dalla pala del presbiterio raffigurante il Martirio di Santa Barbara, di Domenico Brusasorci (1564) con motivi legati alla tradizione mantovana, ma anche alla tradizione coloristica veneta, alle ante dell'organo concordemente attribuite a Fermo Ghisoni che, aperte, svolgono il tema dell'Annunciazione con attento senso realistico, mentre, chiuse, propongono le monumentali figura di Santa Barbara e di San Pietro (1566). Risentono dell'esperienza romana appena conclusa, le due grandi tele di Lorenzo Costa il Giovane, che illustrano il Battesimo di Costantino (a destra), terminato alla fine del 1571 ed il Martirio di Sant'Adriano (a sinistra), iniziato nel 1570, entrambi su disegno del Bertani. A sinistra dell'ingresso, al primo altare, è di Teodoro Ghisi la tela del Battesimo di Cristo e, sempre a sinistra, vicino al presbiterio, è la Lavanda dei Piedi di Ippolito Andreasi, detto l'Andreasino. A destra dell'ingresso, sul primo altare è la tela di Luigi Costa, La Consegna delle Chiavi, mentre, sempre a destra e vicino al presbiterio, è la pala d'altare con Santa Margherita d'Antiochia, di Giovanbattista Giacarelli (1572). Nella cappellina a sinistra dell'ingresso, che ha invaso, con quella che le corrisponde a destra, lo spazio del vestibolo prima passante, è pala d'altare il quadro di Giuseppe Bazzani, databile intorno alla metà del XVIII sec., raffigurante la Madonna col Bambino, San Luigi Gonzaga e Santa Margherita.
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