Istituito nel 1923 in occasione del IV centenario della morte di Pietro Perugino, è stato riaperto nel 2000 con un nuovo allestimento, che si snoda nelle 26 sale, su due piani, attraverso i suggestivi resti del Palazzo di Martino IV, del Palazzo dei Consoli, del Capitolo dei Canonici. Un lapidario è ubicato nei sotterranei pertinenti all’impianto urbanistico della città etrusco-romana.


Allestito con opere d’arte e arredi liturgici provenienti da chiese della diocesi, dal duomo e da donazioni, conserva numerosi dipinti e sculture dal XIV al XIX secolo, tra cui opere della bottega di Arnolfo di Cambio e di Agnolo Daddi, altre di Meo da Siena, Giannicola di Paolo, Bartolomeo Caporali. Per il primo manierismo e il Seicento sono lavori dei Danti, dello Scaramuccia, di Batini. Di particolare rilievo è la Pala di Sant’Onofrio di Luca Signorelli giovane (1484), raffigurante la Madonna in trono con Bambino, un angelo musicante, e ai lati i santi Giovanni Battista, Onofrio, Lorenzo e il committente.