La Pinacoteca si trova a pochi minuti dalle Due Torri, all'interno dell’ex Noviziato Gesuita di Sant'Ignazio, eretto nella seconda metà del 1600 per accogliere i giovani desiderosi di entrare nella Compagnia di Gesù.
Oltre alla Pinacoteca, il Palazzo ospita anche l’Accademia di Belle Arti e la Soprintendenza per il Patrimonio Storico Artistico ed Etnoantropologico, fondendo così esposizione, tutela, conservazione e studio del patrimonio storico culturale.
Nel 1762, Monsignor Francesco Zambeccari dona parte dei propri dipinti cinquecenteschi all'Accademia Clementina, originata dalla prestigiosa Accademia dei Desiderosi creata dai Carracci nel 1582, dando così vita alla collezione.
Dal 1803 l'Accademia di Belle Arti prende il posto della Clementina e diventa Quadreria, acquisendone il patrimonio artistico arricchito nel tempo da altre donazioni.
Soppressa l'Istituzione da parte delle truppe napoleoniche, le opere di rilevanza furono inviate a Parigi e a Milano (rispettivamente al Musée Napoleon e alla futura Accademia di Brera), dove rimasero fino alla caduta dell'impero francese per poi in parte rientrare nella loro “patria” originaria, la Quadreria, in seguito diventata Pinacoteca.
Nacque così la base dell'attuale raccolta: il primo catalogo con 274 dipinti è del 1827.
Grazie ad ulteriori acquisizioni, la Pinacoteca bolognese, già forte di un imponente patrimonio religioso, si arricchisce di opere eseguite per laici e patrizi, completando il percorso dell'arte dal XIII al XVIII secolo e divenendo una delle più preziose raccolte d'arte europee.
Annoverata tra le più moderne e importanti Gallerie Nazionali, la Pinacoteca di Bologna apre al pubblico nel 1885, dopo essere stata separata dall'Accademia.
L'esposizione si articola in sezioni suddivise storicamente per scuole: e l'itinerario ripercorre le opere di autori risalenti al XIII e XIV secolo (Vitale di Bologna, ecc. ), al periodo del Rinascimento (Raffaello, Perugino, Tintoretto, ecc. ), del Manierismo (Giorgio Vasari, Bartolomeo Cesi, ecc. ), all'Età Barocca (i Carracci, il Guercino, ecc. ) per arrivare infine alla Sala dei dipinti seicenteschi di grande formato.    
Totalmente rinnovata nel 1997, la Pinacoteca presenta ora, oltre alle 30 sale espositive, le Sale delle Belle Arti e locali modernamente attrezzati allestiti nel piano interrato, grazie ai quali l'edificio accoglie mostre temporanee di medio e grande respiro, attività didattiche, seminari e convegni.