Dentro de las Catacumbas de San Sebastiano, cuatro niveles han sido excavados. Cerca de las catacumbas, el Camino de los Apios pasa por un valle. En sus laderas se construyeron casas y columbarios. En el fondo del valle (llamado "ad catacumbas" ahora sinónimo de cementerio subterráneo) se erigieron tres mausoleos que probablemente marcaron el inicio del cementerio. Cuando la Iglesia se convirtió en propietaria del sitio en el siglo III, los mausoleos estaban cubiertos por una plataforma dispuesta como un patio cubierto llamado triclia. En el siglo IV se construyó una basílica con una nave y dos pasillos sobre las estructuras anteriores y rodeada de mausoleos. Fue aquí, cerca de donde los apóstoles Pedro y Pablo fueron venerados, que San Sebastián fue enterrado. Fue un soldado martirizado durante la persecución en el reinado de Diocleciano (284-305). Cuando finalmente se descubrió que era cristiano, en 286, fue entregado a los arqueros de Mauritania, quienes lo atravesaron con flechas; finalmente fue asesinado por los golpes de un club y su cuerpo fue arrojado a la Cloaca Maxima. Milagrosamente se apareció a la matrona Irene, quien recogió su cuerpo y llevó a las catacumbas que llevan su nombre. Su culto se hizo tan popular que en el siglo V se excavó una cripta alrededor de su tumba. La basílica fue modificada en el siglo XIII y luego reconstruida en el siglo XVII por el cardenal Scipio Borghese. La nueva iglesia fue construida sobre la nave del edificio anterior.

El recorrido de esta catacumba, que tiene tumbas paganas del siglo II junto con capillas cristianas, lo llevará por una escalera llena de pedazos de sarcófagos con sellos imperiales. Debajo de la iglesia, verás un área con tres tumbas paganas decoradas con algunos frescos muy atractivos y un mosaico en el piso. Se cree que tanto los funerales cristianos como los paganos se llevaron a cabo en la elaborada capilla central, cuya bóveda tiene decoraciones de estuco y hojas de loto. La capilla de los símbolos tiene los primeros símbolos cristianos grabados en ella. Subiendo otra escalera hay un comedor para banquetes funerarios. El graffiti se remonta al siglo II.