Die Kirche Sant'Agnese fuori le Mura wurde 324 auf Befehl von Costanza, der Tochter von Kaiser Costantino, auf den Ruinen eines Friedhofs und den Katakomben errichtet, die die Reliquien des Heiligen beherbergen. Es wurde im Auftrag von Papst Onorio I umgebaut und später mehrmals restauriert.

Es ist eines der wichtigsten Beispiele einer antiken christlichen Basilika. Die Fassade beherbergt ein wundervolles Renaissanceportal, das mit dem Emblem des aufkommenden Papstes Giulio II geschmückt ist, und wird von einem Sprossenfenster überragt.

Eine große Marmortreppe aus dem Jahr 1590 führt zum Narthex der Kirche hinunter. An den Wänden finden sich Fragmente von Grabsteinen und architektonische Elemente aus den Katakomben.

Der Innenraum, dem der Narthex vorausgeht, verkörpert drei Schiffe, die durch vierzehn antike Säulen getrennt sind, mit schönen korinthischen Kapitellen.

Sehr interessant ist das Mosaik, das Sant'Agnese als byzantinische Kaiserin auf goldenem Grund darstellt, eines der höchsten Beispiele byzantinischer Kunst in Rom.

Jedes Jahr, am 21. Januar, werden in der Kirche zwei Lämmer gesegnet, und ihre Wolle wird verwendet, um ein "Pallium" einzuwickeln, das der Papst den frisch ernannten Erzbischöfen gibt.