Das Museum ist in den Räumen des alten Benediktinerklosters S. Matteo in Soarta (11. Jahrhundert) untergebracht, von dem nach dem letzten Krieg nur wenige Umbauten und Restaurierungen übrig geblieben sind, abgesehen von der Kirche und einigen mittelalterlichen Mauerstücken.

Der spätmittelalterliche Kreuzgang wurde aus Ziegeln mit doppelten Pfosten und Säulen und Kapitellen errichtet, von denen fast alle Originalbauten im Obergeschoss sind. Die Kolonnade wurde im 16. Jahrhundert weitgehend umstrukturiert, zusammen mit anderen Teilen, die für die Öffentlichkeit nicht zugänglich waren. Zu Beginn des 19. Jahrhunderts wurde ein Kapitel von Kanonissen errichtet, und wahrscheinlich wurde zu dieser Zeit der neoklassizistische Eingang gebaut. Zwischen 1866 und 1940 wurde es zum städtischen Untersuchungsgefängnis, das viel Strukturanpassung erforderte.

Die Umwandlung in ein Museum und die Restaurierung des Gebäudes fanden in den Jahren nach dem Zweiten Weltkrieg statt. Das Nationalmuseum San Matteo wurde 1949 dank Piero Sanpaolesi geboren. Grundlage war die ästhetische Qualität der gezeigten Arbeiten. Später wurde beschlossen, die Exponate nach Typen zu gruppieren und die ursprünglichen Ensembles wieder zusammenzuführen.

Das Museum enthält die größte Kunstsammlung in Pisa. Es verfügt über einen bemerkenswerten Vorrat an mittelalterlichen Töpferwaren, im Wesentlichen Keramikbecken aus dem gesamten Mittelmeerraum sowie mittelalterliches und modernes Geschirr, das bei Ausgrabungen in Pisa gefunden wurde (Sammlung Tongiorgi). Es gibt mehrere wertvolle Juwelen und eine Auswahl mittelalterlicher Münzen und Siegel aus den Kollektionen Franceschi und Supino. Der wichtige Abschnitt mit beleuchteten Kodizes enthält Beispiele aus dem 12. bis 14. Jahrhundert, die bemerkenswert reich an Illuminationen sind. Es gibt Steinstatuen aus dem Mittelalter bis ins 16. Jahrhundert, vor allem schöne Beispiele romanischer Skulpturen und Meisterwerke von Nicola Pisano und Donatello. Es gibt auch eine Sammlung von Holzskulpturen und relevanten Gemälden mit über zweihundert Werken, die vom frühen 13. Jahrhundert bis in die Neuzeit reichen, von bedeutenden Künstlern wie Giunta Pisano, Berlinghiero, Simone Martini und Masaccio, um nur einige zu nennen.