Der Bau begann am 17. April 1565, um eine Kirche für den Ritterorden von St. Stephan zu errichten, die vom Großherzog Cosimo de 'Medici zur Bekämpfung der sarazenischen Piraterie im Mittelmeerraum gegründet wurde. Das von Giorgio Vasari und David Fortini entworfene und geplante Projekt bestand darin, an der Stelle einer älteren Kirche namens San Sebastiano alle Fabbriche Maggiori eine Kirche zu bauen, die mindestens auf das Jahr 1074 datiert war. Die neue Kirche am Ort wurde am 21. Dezember eingeweiht , 1569. Die Fassade aus weißem Marmor wurde von Don Giovanni de 'Medici, einem unehelichen Sohn von Cosimo I, mit der Hilfe von Alessandro Pieroni entworfen. ihre Entwürfe wurden nach dem ursprünglichen Plan von Vasari ausgewählt. Eine Inschrift erinnert an die Vollendung während der Regierungszeit von Ferdinando I de 'Medici.

Der ebenfalls von Vasari entworfene Glockenturm wurde 1572 von Giovanni Fancelli fertiggestellt. Die Hauptaltarentwürfe stammen von Pier Francesco Silvani. Viele Änderungen und Ergänzungen wurden in den nächsten zwei Jahrhunderten vorgeschlagen und vorgenommen, darunter Pläne von Gherardo Mechini, Paolo Guidotti, Ranieri Gherardi, Torpè Donati, Alessandro Gherardesca, Florido Galli, Niccolò Matas und Pasquale Poccianti. Die endgültige Rekonstruktion im Jahr 1859, die nach der Unterdrückung der Ordnung abgeschlossen wurde, führt zu einer klareren inneren Systematisierung der Säulen, die wir heute sehen.
Die Kirche zeigt zahlreiche Trophäenbanner, die bei Begegnungen der Marine mit sarazenischen Piraten eingefangen wurden. Die Schrift für das heilige Wasser (1568) wurde von Giovanni Fancelli nach Entwürfen von Vasari gestaltet.

In der Gegenfassade befinden sich fünf monochrome Gemälde von St Stefano Papst und Märtyrer, von denen eines am 31. März 1588 den Eingang von Ferdinando I feiert. Dieser Großherzog beauftragte die Holzdecke von Bartolomeo Atticciati ( 1604).

The Ceiling zeigt sechs Gemälde auf Holz mit Episoden historischer Ereignisse, in denen die militärische Ordnung aktiv war, darunter die Gewährung von Uniformen durch Cosimo I de 'Medici von il Cigoli, die Rückkehr der Flotte aus der Schlacht von Lepanto und Entlassung von Prevesa durch Jacopo Ligozzi, Die Abschiebung von Livorno von Maria de 'Medici durch Allori, Sieg im griechischen Archipel und Gefangennahme von Bona durch Empoli.

Die polychrome Kanzel (1627) wurde von Chiarissimo Fancelli fertiggestellt. Es enthält Gemälde des Pisaner Aurelio Lomi von Madonna und Kind mit den Heiligen Joseph und Stefano (1593) und ein Gemälde des Palastes des Ordens. Der Hauptaltar (1702–1709) im Presbyterium wurde von Giovanni Battista Foggini mit einer Statue des Papstes St. Stefano und allegorischen Figuren von Religion und Glauben entworfen und gestaltet. Auf dem Bronzethron ist ein Relief mit der Enthauptung des hl Stefano. Auf der rechten Seite befindet sich ein Gemälde von Giorgio Vasari mit der Grablegung des Hl. Stefano (1571), auf der rechten Seite eine Geburt Christi (1564) von Bronzino.

In der Sakristei befindet sich eine Skulpturengruppe von Foggini von St. Stefano und der Allegorie der Vernunft und der Dreifaltigkeit (1683), die anlässlich der Übersetzung der Leiche des Heiligen in diese Kirche im Jahr 1682 angefertigt wurde.

Die Kapelle des Heiligen Sakraments wurde 1837 von Florido Galli fertiggestellt.