La vicenda storico-artistica del Santuario è strettamente legata al suo carattere devozionale. Un primo oratorio venne edificato alla fine del XIV secolo dai Terziari francescani per ospitare la tavola raffigurante l'immagine della Madonna. Storia e leggenda si intrecciano sull'origine del dipinto, che la tradizione popolare vorrebbe giunto miracolosamente dalla Grecia nel 1345 e trasportato sulla cima del monte da un pastore storpio. La piccola chiesa, sorta grazie alle elemosine dei cittadini, si rivelò ben presto inadeguata al grande afflusso di fedeli. 

L'Arcivescovo di Pisa decise quindi di affidare la custodia ai monaci Gesuati che nel 1445 procedettero ad ampliarne le dimensioni. All'epoca l'architettura del Santuario era costituita da un'unica aula rettangolare a sviluppo longitudinale che terminava con l'altare marmoreo di Silvio Cosini (1530) conservato ora nella sacrestia. Alla soppressione dei Gesuati, nel 1668, Montenero passò ai Teatini che conferirono al Santuario l'aspetto attuale. Le pitture dell'atrio ellittico sono opera del converso teatino Filippo Maria Galletti. Le immagini che si ispirano alle Storie di Maria sono inserite in un contesto decorativo che evoca simbolicamente il giardino come metafora del Paradiso. 

L'interno, di chiara ascendenza barocca, è impreziosito da ornati in stucco e da una grande profusione di marmi policromi. Nei sei altari laterali sono ricordate le compagnie che contribuirono con le loro offerte alla fabbrica di Montenero. Sostenuto dagli archi delle cappelle e dai contropilastri, un cornicione in stucco corre lungo la navata. Nei vani tra le finestre, ancora tele del Galletti raffiguranti Storie di Giuseppe e di Maria. Il soffitto ligneo disegnato e intagliato nel 1680 dal pisano Pietro Giambelli ospita tre grandi quadri riportati con episodi della vita di San Gaetano da Thiene, fondatore dei Teatini, sempre del Galletti. Nel 1721 cominciarono i lavori per la costruzione di una nuova cappella.